隨著國家對生物毒素類污染殘留的監(jiān)管力度加大，各級實(shí)驗室都面臨著盡快建立切實(shí)可行的檢測方法，普瑞邦(Pribolab)特組織技術(shù)人員認(rèn)真研讀食品、糧油、飼料（以及寵物食品）及中藥等行業(yè)真菌毒素檢測國家標(biāo)準(zhǔn)以及國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測要求，并在此就2020版藥典《中國藥典》編寫了《中藥材中黃曲霉毒素分析方法解決方案》，供中藥材檢測實(shí)驗室人員參考查詢。普瑞邦自成立以來，始終堅持誠信、協(xié)作、創(chuàng)新、發(fā)展的價值觀，肩負(fù)立足創(chuàng)新，以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品賦檢測于精準(zhǔn)，以創(chuàng)新技術(shù)推進(jìn)檢測技術(shù)進(jìn)步的使命，專注于真菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)。繼2017年全自動免疫親和柱操作儀推出之后，2018年年初普瑞邦（青島）技術(shù)中心在國內(nèi)率先推出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的展青霉素、嘔吐毒素、環(huán)匹阿尼酸、黃曲霉素等一系列13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，成為全球第二家擁有自主研發(fā)生產(chǎn)真菌毒素13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的供應(yīng)商。產(chǎn)品線涵蓋真菌毒素固/液標(biāo)準(zhǔn)品、13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控樣品、前處理凈化柱(多功能凈化柱和免疫親和柱、分子印跡柱) 、酶聯(lián)免疫試劑盒、檢測卡以及樣品前處理自動化儀器（全自動免疫親和柱操作儀、自動化均質(zhì)器、自動配標(biāo)儀），光/電化學(xué)類衍生器等設(shè)備。也提供維生素、抗生素、過敏原檢測、轉(zhuǎn)基因檢測和食品酶法分析試劑盒等多類產(chǎn)品。我們不僅承諾為您提供質(zhì)量可靠、穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的色譜耗材和儀器，同時保證售前、售中和售后完備的產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)。如您工作中涉及實(shí)驗方法開發(fā)、色譜條件優(yōu)化、產(chǎn)品選擇、使用方法指導(dǎo)等問題請撥打免費(fèi)服務(wù)熱線13311409196。二、 2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀三、 SN/T 4604-2016進(jìn)出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）五、 Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定
一、2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法
本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。4. ①碘衍生法：衍生溶液為0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀釋至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃；②光化學(xué)柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化學(xué)柱后衍生器.Pribolab-MDU光化學(xué)柱后衍生器）5. 熒光檢測器檢測，激發(fā)波長：360nm(365nm) 發(fā)射波長：450nm6. 兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。精密量取PriboFast ? STD#1082AFT黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0μg/mL、0.3μg/ mL、1.0μg/ mL、0.3μg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備溶液。精密量取儲備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。1. 取供試品粉末約15g(過二號篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度大于11,000 r/min,普瑞邦均質(zhì)器Pribolab? WR800: 轉(zhuǎn)速22,000 r/min）。3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（專用淋洗緩沖液）稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min）4. 準(zhǔn)確移取20.0mL樣品提取液，過PriboFast? 免疫親和柱，過柱時流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。5. 用水20mL洗脫（必要時可先用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗滌液棄去。6. 為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進(jìn)行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當(dāng)溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進(jìn)行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(免疫親和柱操作建議使用PriboFast?泵流操作架,便于控制各個步驟流速,保證較好的回收率)7. 測定法：分別精密吸取上述混合對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計算，即得。第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。（一）色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵硅膠填充劑；以10mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；柱溫25℃；流速0.3mL/min；按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。
以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測；噴霧離子源ESI)，采集模式為離子模式；各化合物監(jiān)測離子對和撞壓(CE)見下表。
精密量取黃曲霉毒素混對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含黃曲霉毒素B2、G2濃度為0.04?3ng/mL，黃曲霉毒素B1、G1濃度為0.12?l0ng/mL的系列對照品溶液，即得（必要時根據(jù)樣品實(shí)際情況，制系列基質(zhì)對照品溶液）測定法精密吸取上述系列對照品溶液各5μL,注入高效液相色譜-質(zhì)譜，測定峰面積，以峰面積縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)。另精密吸取上述供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計算，即得。本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1，或黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。精密量取 PriboFast?STD#1041黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，PriboFast?STD#1082AFT黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用硫酸鹽緩沖液稀釋成每1L含0 μg、0.05 μg、0.15 μg、0.45 μg、1.35 μg（測定黃曲霉毒素B1）或0 μg、0.025 μg、0.075 μg、0.225 μg、0.675 μg（測定黃曲霉毒素總量）的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即得。1. 供試品粉末2.0g至50mL離心管中，20mL甲醇振蕩5min，離心5min（3000r/min）。2. 取2mL上清液至10mL干凈離心管中，50-60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈伞?/span>3. 加入2mL去離子水振動30秒，加入6mL三氯甲烷振蕩2min，離心5min（3000r/min）。4. 取下層三氯甲烷液3-10mL于離心管中，置氮吹儀于50-60℃水浴濃縮至干，加入1mL正己烷渦旋30秒，再加入2mL磷酸鹽緩沖液渦旋1min，離心5min（3000r/min），取下層液，即得。 黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素總量的測定：分別采用合適濃度的抗體包被微孔板孔，經(jīng)封閉、干燥等處理后加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入經(jīng)酶標(biāo)抗原稀釋液稀釋至合適工作濃度的酶標(biāo)抗原，混勻，于25℃反應(yīng)45min，用洗滌工作液洗滌，每孔加入底物顯色液100μL，于25℃反應(yīng)15min，每孔加入終止液50μL，采用酶標(biāo)儀于450nm處，參比波長630nm，測定每孔吸光度值。（1）測定前，可選擇陰性樣本進(jìn)行添加回收試驗，樣本回收率應(yīng)在60%-120%。（2）線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990。（3）供試品溶液百分吸光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時，須對已制備好的供試品溶液進(jìn)行稀釋，使其百分吸光率落入曲線范圍后再檢測。（4）當(dāng)測定結(jié)果超出限度時，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。1.本實(shí)驗應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。2.殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。
二、2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀
三、SN/T 4604-2016 進(jìn)出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口中藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口當(dāng)歸、桔梗五味子、枸杞、大青葉、金銀花、地龍中黃曲霉素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5 000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下,將50 mL提取液B全部通過免疫親和柱(PriboFast?復(fù)合免疫親和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐溫的PBS淋洗親和柱，再將5mL提取液A通過免疫親和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通過親和柱，用5mL含0.1%吐溫的PBS和20mL水淋洗親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱，棄去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，當(dāng)甲醇大部分過柱時，停止加壓，靜置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；將淋洗液置于40℃下水浴氮?dú)獯蹈?，? mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(40：60體積比)溶解殘渣，過0.22 μm有機(jī)系濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。
四、復(fù)雜中藥材樣品測定解決方案
針對目前藥典方法檢測中藥材中黃曲霉毒素過程中出現(xiàn)的決明子、遠(yuǎn)志、檳郎等個別樣品基質(zhì)復(fù)雜，凈化效果差，譜圖中雜質(zhì)峰過多的問題，普瑞邦技術(shù)中心制定了一套針對中藥材前處理的解決方案。應(yīng)用此解決方案進(jìn)行樣品前處理，經(jīng)高效液相色譜柱后光化學(xué)衍生進(jìn)行檢測可達(dá)到較好的凈化效果，雜峰明顯減少，使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。供廣大同行老師參考：
圖1 方法優(yōu)化后（左）與優(yōu)化前（右）遠(yuǎn)志樣品過柱對比
圖2 方法優(yōu)化后遠(yuǎn)志樣品加標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)品疊加對比
圖3 方法優(yōu)化前遠(yuǎn)志樣品加標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)品疊加對比
五、Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定
通過Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在2015版藥典中檢測黃曲霉的案例，對比手工的精密度和回收率。全自動免疫親和操作儀不但在具體的方法操作和技術(shù)運(yùn)用上更加先進(jìn)，而且在整個分析過程中都有非常嚴(yán)格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，確保分析結(jié)果準(zhǔn)確，排除人為操作造成的實(shí)驗誤差。
*注：上表采用遠(yuǎn)志樣品，按照10μg/kg進(jìn)行添加。
Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在進(jìn)行過免疫親和柱實(shí)驗中得到了優(yōu)于手動過柱的結(jié)果，通過比對不難發(fā)現(xiàn)，Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在回收率和精密度方面有所提高，大大節(jié)省了人力以及時間成本，同時也縮短了實(shí)驗人員接觸試劑的時間，最大程度地保證了實(shí)驗人員的安全。
六、中藥材黃曲霉毒素測定采購指南
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| 254nm低壓紫外燈光源+15米反應(yīng)池 | | | |
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| 低壓紫外燈光源+全透明質(zhì)化反應(yīng)池 | | | |
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| (AFB1,G11.0μg/mL;AFB2,G20.3μg/mL) | | | |
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*備注包括1年免費(fèi)保修和終身維護(hù)(反應(yīng)池和納米燈管除外).
七、中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例
1.樣品中目標(biāo)峰保留時間發(fā)生偏移此文件僅供參考，具體內(nèi)容以2020版藥典為準(zhǔn)。2020版藥典解讀一：真菌毒素分析方法驗證
2020版藥典解讀二：較15版藥典真菌毒素測定要求及方法變化解讀
2020版藥典解讀三：不同毒素檢測方法對比
